ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ПРЕПАРАТА ГУМИНОВОЙ ПРИРОДЫ «NEROORIGINAL», ПРЕДСТАВЛЕННОГО ЗАКАЗЧИКОМ, НА ПРОЦЕССЫ РОСТА И РАЗВИТИЯ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ И УРОВЕНЬ ОБМЕННЫХ ПРОЦЕССОВ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

1.Материалы и методы исследования

Исследования проводили на лабораторных белых (беспородных) крысах, разделенных на 7 групп, по 5 животных в каждой. Животные содержались в отдельных клетках, условия содержания, поения и кормления были одинаковыми и соответствовали стандарту их содержания в условиях вивария. Крысам 1-ой группы ежедневно вводили по 1 мл дистиллированной воды, а животным 2-7 групп по 1 мл раствора, содержащих различное количество гуминовых веществ соответственно выбранным дозам по действующему веществу.

Схема эксперимента:

1. контроль (5 животных) 2. 5 мг/кг массы тела (5 животных) 3. 10 мг/кг массы тела (5 животных) 4 20 мг/кг массы тела (5 животных) 5. 30 мг/кг массы тела (5 животных) 6. 40 мг/кг массы тела (5 животных) 7. 50 мг/кг маccы тела (5 животных) . Рис.1 Растворы гуминовой природы препарата «NeroOriginal», представленного Заказчиком.

Выпаивание проводилось на протяжении 19 дней с 07.09.15 по 25.09.15, ежедневно по 1мл перорально с помощью катетера, который позволял точно дозировать количество препарата для каждого животного. Катетер вводили крысам по задней стенке пищевода на 1/3 длины, затем медленно вводили препарат.


В определенные периоды жизни проводилось взвешивание животных: 07.09.15 – первый период жизни; 14.09.15 – второй период жизни; 21.09.15 – третий период жизни и 25.09.15 - четвертый период жизни. Взвешивание проводилось индивидуально для каждого животного, с помощью весов (Saturn ST-KS7235 Red), точность до 1г.


25.09.15 проводилось последнее взвешивание. Перед вскрытием, по законам биоэтики, применяли тиопентал. У крыс для исследования был взят биологический материал (кровь, а также ткани и органы.).


После вскрытия брюшной полости у каждого животного осматривали внутренние органы, определяли их состояние, структуру и особенно обращали внимание на окраску кишечника. Взятие крови проводили напрямую из правого желудочка сердца. Кровь стабилизировали гепарином.


У каждого животного , кроме образцов крови, отбирали печень, сердце, желудок и поджелудочную железу. Каждый орган взвешивали отдельно, а затем рассчитывали индекс каждого из этих органов.


В стабилизированной крови определяли количество форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитови тромбоцитов), уровень гемоглобина, гематокрита и цветного показателя определяли на Automated Veterinary Hematology Analyzer PCE 90Vet с помощью общепринятых методик. Индексы эритроцитов (MCV, MHC, MCHC) определяли расчетным методом. Оставшуюся кровь центрифугировали с целью получения плазмы. В плазме определяли содержание общего белка с помощью реактива Бретфорда, выражали в мг/мл. Общую активность трипсиноподобных ферментов плазмы определяли по способности α1-ИП плазы крови подавлять гидролиз трипсином N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (БАПНА), выражали в мкмоль/л.

Уровень α1-Ингибитора протеиназ определяют с помощью соевого ингибитора и выражают в г/л или мкмоль/л. В основу метода определения α2-Макроглобулина положен принцип, заключающийся в том, что α2-М количественно образует с трипсином активный (способный расщеплять БАПНА) комплекс, который не чувствителен к ингибитору из бобов сои (К. Н. Веремеенко, Л. И. Волохонская, 1969). При расщеплении БАПНА трипсином образуется окрашенный в жёлтый цвет п-нитроанилин, количество которого определяют спектрофотометрически при длине волны 383 нм (B. Erlanger и соавт. 1961).

Результаты исследований обрабатывали с использованием статистических критериев для малых выборок. T-критерий Стьюдента (метод косвенных разниц) применяли для проверки гипотезы о достоверности разницы между средними. Необходимыми и достоверными условиями использования t-критерия Стьюдента является нормальность распределения совокупностей и отсутствие разницы между генеральными дисперсиями.

Для этого находили среднее арифметическое значение ряда каждой серии опытов (М).

Среднее квадратическое отклонение средней квадратичной величины (G) определяли по формуле:

G = ± √Σa2 / (n-1);

Для дальнейшего установления степени достоверности результатов находили среднюю погрешность средней арифметической величины:

m = ± G / √n

t - критерий Стьюдента определяли по формуле:

t = IMк-MдI / √G2к + √G2д

Гипотезу о грубых ошибки проверяли с помощью правила "трех сигм" и критерия Шовэнь. Если варьирования элементов выборки отклонялось от нормального, для установления разницы между двумя средними использовали непараметрические критерии (U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни). Результаты, представленные в таблицах, представлены в виде средней ± стандартная ошибка среднего (M ± m). Тесноту связи между проявлениями признаков определяли с помощью коэффициента корреляции.

Расчеты проводились с помощью IBM-совместимого компьютера с использованием программе "Excel2013". Изменения показателей считали достоверными при P <0,05.

Результаты исследований

Клинические показатели.

Эксперимент длился 19 суток. За весь период во наблюдения животные были физиологически активны и не проявляли беспокойства. Кроме того, нужно также отметить, что угнетенного поведения у крыс во всех опытных группах мы не наблюдали. При ежедневном осмотре было установлено, что по состоянию шерсти, ушных раковин, слизистой глаз интактные животные и те, которым выпаивали препарат «NEROORIGINAL» в различных дозах, практически не отличались, т. е. внешние проявления токсичности применяемой кормовой добавки гуминовой природы отсутствовали.

2.2 Рост и развитие. Состояние внутренних органов.

О динамике роста и развития крыс судили по изменению их массы,прироста массы за весь период наблюдения и среднесуточного прироста массы за отдельные периоды роста между взвешиваниями, а также за весь период наблюдения.